siRNA干擾載體構建與引物設計

 

siRNA干擾載體構建與引物設計

 

siRNA干擾載體構建過程中，針對siRNA設計的引物是怎么設計的?

一般是合成一對引物，然后退火，再與線性化的載體做連接。由于引物比較長，所以合成時一般都會有比較多的堿基突變，因此，做shRNA表達載體構建的主要難度，在于篩選出正確的克隆，有時候可能要選很多個克隆測序才能篩到想要的。具體的序列組成，一般是sense-loop-antisense。不同的公司會有不同的設計原則的。

經驗：我們一般不去考慮構建載體來得到siRNA！
載體表達siRNA方法主要存在以下缺點：
1、外源導入shRNA的表達會干擾細胞本身miRNA的正常表達，而miRNA在基因的表達調控方面有著至關重要的作用，目前已經證實很多疾病的產生通miRNA的表達異常存在確切關系，已有很多文獻報道和證實；
2、載體構建的周期長，操作較為復雜，試驗重復性不好，做過的人應該大多都知道；
3、載體用于體內試驗的毒性非常大，容易激發機體強烈的免疫應答反應，副作用大，已有多篇文獻證實；
4、通量低，影響因素更多，體內試驗的效果很差，存在安全性的問題；
5、shRNA的表達在時間和表達量上都較難控制等。
這也是為什么現在10多種進入臨床試驗的RNAi藥物幾乎都是用化學合成的siRNA來做的原因！